1.介紹

肝臟是機體代謝和解毒的主要器官。它在體內(nèi)營養(yǎng)儲存、異源物質(zhì)代謝、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，幼齡動物由于生理上的不成熟性，容易受到包括飲食和環(huán)境應(yīng)激在內(nèi)的各種應(yīng)激源誘導(dǎo)的肝損傷。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肝損傷發(fā)生和發(fā)展的重要病理機制。過量的活性氧（ROS）可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷。更重要的是，自由基干擾線粒體動力學(xué)和生物能量學(xué)過程，進而引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，進而加重肝臟細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，觸發(fā)內(nèi)源性凋亡通路，最終導(dǎo)致肝臟損傷和功能障礙。因此，有必要制定有效的營養(yǎng)干預(yù)策略，保護動物免受氧化應(yīng)激引起的肝損傷損傷。

近年來，人們嘗試通過膳食抗氧化劑如植物營養(yǎng)素來改善肝臟健康。水飛薊賓作為黃酮類木脂素的一種，是從水飛薊中提取的水飛薊素的主要活性成分，在消除ROS和調(diào)節(jié)抗氧化能力方面起著至關(guān)重要的作用。此外，水飛薊賓還具有廣泛的藥理活性，如保肝、抗炎和抗菌活性，并通過調(diào)節(jié)生物發(fā)生和生物能量學(xué)來改善線粒體功能。據(jù)報道，飼糧中添加水飛薊素/水飛薊賓可以提高豬和家禽的生長性能，并對全身健康起到促進作用。與此一致的是，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加水飛薊賓可以降低斷奶仔豬腹瀉發(fā)生率，提高生長性能；此外，水飛薊賓可通過改善斷奶仔豬的抗氧化性能、線粒體功能和微生物群落組成，有效緩解腸道損傷。然而，水飛薊賓對氧化應(yīng)激狀態(tài)下斷奶仔豬肝臟健康的有益影響及其潛在機制尚不清楚。

因此，本研究的目的是探討水飛薊賓在減輕百草枯（PQ）誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷中的潛力。PQ是一種眾所周知的氧化還原失衡誘導(dǎo)劑，可以通過干擾線粒體呼吸鏈上的電子傳遞而持續(xù)產(chǎn)生ROS，從而誘導(dǎo)不同器官的損傷，包括肝臟、胃腸道和其他器官。因此，它被廣泛用于建立氧化應(yīng)激模型。我們測量了飼糧中添加水飛薊賓對肝臟病理改變、血漿生化參數(shù)、肝酶活性和炎癥細(xì)胞因子含量的影響。隨后，進一步分析了Nrf2/Keap1和NF-κB信號通路的激活、線粒體功能相關(guān)基因和蛋白的表達以及肝細(xì)胞凋亡的啟動。我們的研究結(jié)果可以為改善斷奶仔豬肝臟健康提供一種新的營養(yǎng)干預(yù)策略，并為水飛薊賓在動物飼料中的加入和利用奠定理論基礎(chǔ)。

2.材料與方法（略）

3.結(jié)果

3.1 飼糧添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)仔豬肝損傷的影響

如圖1A所示，H&E染色顯示，PQ導(dǎo)致仔豬肝細(xì)胞腫脹和空泡變性，并伴有肝核固縮和核溶解。相反，飼糧中添加水飛薊賓可緩解上述病理變化。與PQ組相比，飼糧中添加水飛薊賓顯著降低了PQ誘導(dǎo)仔豬肝臟病變的組織學(xué)評分（p<0.05）（圖1B）。然后，我們進一步測定了血漿中AST、ALT和ALP的活性，發(fā)現(xiàn)PQ顯著提高了ALT活性（p<0.05）。而飼糧中添加水飛薊賓則會明顯降低PQ誘導(dǎo)仔豬的ALT活性（p<0.05），并有降低AST活性的趨勢（p=0.07）（圖1C，D）。此外，常規(guī)飼糧和PQ處理均未影響仔豬血漿ALP活性（p>0.05）（圖1E）。

3.2 飼糧添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)仔豬肝臟氧化應(yīng)激的影響

如圖2所示，與對照組相比，PQ誘導(dǎo)仔豬GSH-Px活性顯著降低（p<0.05），H₂O₂水平顯著升高（p<0.05），T-AOC水平趨于降低（p=0.10），MDA含量趨于升高（p=0.08）（圖2C-E）。相反，飼糧中添加水飛薊賓顯著提高了T-AOC水平，降低了MDA和H₂O₂濃度（p<0.05），并有提高SOD活性（p=0.06）和GSH-Px活性（p=0.06）的趨勢（圖2B-E）。各組間CAT活性差異無顯著差異（p>0.05）（圖2A）。

3.3 飼糧添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)仔豬肝臟Nrf2信號通路激活的影響

如圖3所示，我們發(fā)現(xiàn)PQ誘導(dǎo)顯著降低了GPX4基因的表達（p<0.05），但對SOD1和GPX1基因的表達沒有影響（p>0.05）（圖3B-D）。然而，飼糧中添加水飛薊賓顯著提高了PQ誘導(dǎo)仔豬肝臟中SOD1mRNA表達量（p<0.05），并有提高GPX1（p=0.097）和GPX4（p=0.099）表達量的趨勢（圖3B-D）。添加水飛薊賓和PQ處理均未影響肝臟中CAT mRNA的表達（p>0.05）（圖3A）。有趣的是，Western blotting結(jié)果顯示，在存在或不存在PQ刺激的情況下，添加水飛薊賓增加了核因子NF-E2相關(guān)因子2 ( Nrf2 )蛋白的表達（p<0.05）（圖3E-G）。

3.4 飼糧添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)仔豬炎癥反應(yīng)的影響

如圖4所示，與對照組相比，PQ誘導(dǎo)引起TNF-α和IL-8水平升高（p=0.05和p<0.05）（圖4A,C）。與PQ組相比，水飛薊賓顯著扭轉(zhuǎn)了這些趨勢，增加了肝臟中IL-10的含量（p=0.08）（圖4A,C,D）。與對照組相比，PQ處理后TNF-α和IL-8的mRNA相對豐度上調(diào)（分別為p=0.07和p=0.06）（圖4E、G）。然而，飼糧中添加水飛薊賓顯著下調(diào)了表達（p=0.06和p<0.05）。此外，水飛薊賓顯著降低了PQ處理誘導(dǎo)的核因子-κB（NF-κB）和磷酸化NF-κB蛋白豐度的增加（p<0.05）（圖4I,J）。

3.5 飼糧添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)仔豬線粒體功能的影響

如圖5所示，PQ誘導(dǎo)降低了線粒體復(fù)合物I和V的活性，隨后降低了肝臟中的ATP含量（p<0.05）（圖5A-C）。然而，與PQ組相比，飼糧中添加水飛薊賓可緩解PQ誘導(dǎo)的線粒體復(fù)合體I和V活性降低，從而提高ATP的產(chǎn)生（p<0.05）。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PQ處理降低了NADH泛醌氧化還原酶核心亞基V2（NDUFV2）的表達水平（p<0.05），并有降低ATP合成酶亞基d（ATP5H）的趨勢（p=0.05）（圖5D），而添加水飛薊賓提高了PQ誘導(dǎo)仔豬肝臟中上述基因的表達（p=0.07和p=0.06）。此外，飼糧中的水飛薊賓還上調(diào)了PQ誘導(dǎo)下NADH泛醌氧化還原酶核心亞基S2（NDUFS2）的mRNA表達（p=0.06）（圖5D）。此外，PQ誘導(dǎo)增加了發(fā)動蛋白1（Drp1）的蛋白豐度，降低了線粒體融合蛋白2（Mfn2）的蛋白豐度，而添加水飛薊賓顯著逆轉(zhuǎn)了上述趨勢（p<0.05）（圖5E-G）。

3.6 飼糧添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)仔豬肝細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，PQ誘導(dǎo)顯著提高了肝臟中caspase3和caspase9的活性，而添加水飛薊賓則逆轉(zhuǎn)了這一趨勢（p<0.05）（圖5A,B）。有趣的是，飼糧中添加水飛薊賓有降低未誘導(dǎo)仔豬caspase3和caspase9活性的趨勢（p=0.07和p=0.09）。Western blot分析顯示，與對照組相比，PQ誘導(dǎo)顯著提高了肝臟中Cleaved caspase3的蛋白表達（p<0.01）（圖5D）。相反，添加水飛薊賓顯著下調(diào)Cleaved caspase3的蛋白表達，上調(diào)b細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白表達，增加Bcl-2與Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bax）的比例（p<0.05）（圖5D、E、G）。此外，水飛薊賓還增加了未誘導(dǎo)仔豬中Bcl-2蛋白的表達（p<0.01）（圖5E）。各組間Bax蛋白表達差異無顯著差異（p>0.05）（圖5F）。

4.討論

肝臟是哺乳動物體內(nèi)代謝高度活躍的器官，在維持全身健康中起著重要作用，但極易受到各種因素引起的氧化應(yīng)激的影響。本研究旨在探討水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)斷奶仔豬肝損傷的保護作用及其可能的分子機制。與先前的報道一致，組織病理學(xué)染色分析顯示，PQ誘導(dǎo)引起肝臟明顯的病理變化，表現(xiàn)為肝細(xì)胞核固縮、核溶解和空泡化。然而，添加水飛薊賓可以減輕PQ引起的仔豬肝臟形態(tài)學(xué)損傷，病理學(xué)評分降低證明了這一點。之前的研究還表明，水飛薊賓可以減輕CCl4誘導(dǎo)的肉雞肝臟的纖維化、肉芽腫和細(xì)胞溶解性壞死。AST、ALT、ALP等血漿生化指標(biāo)是肝損害程度最敏感的標(biāo)志物，血漿中這些酶活性升高表明肝損害程度加重。在本研究中，飼糧中添加水飛薊賓可降低PQ誘導(dǎo)仔豬血漿ALT和AST活性，提示水飛薊賓可能對PQ處理引起的肝損傷具有保護作用。這些結(jié)果與張等人（2021）的研究結(jié)果一致，該研究證實，添加膠束水飛薊素可顯著降低母豬產(chǎn)后第21天血清AST活性。此外，添加水飛薊賓降低了北京鴨血清ALT和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的活性。綜上所述，飼糧中添加水飛薊賓對PQ誘導(dǎo)的仔豬肝損傷具有保護作用。

眾所周知，維持適當(dāng)?shù)难趸€原平衡是減輕肝損傷的有效策略。肝細(xì)胞分泌的抗氧化酶是抵御氧化應(yīng)激的第一道防線。尤其SOD是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，催化超氧陰離子自由基歧化成氧和過氧化氫；后者經(jīng)CAT進一步分解為水和氧。此外，GSH-Px還具有較強的清除自由基的能力，T-AOC可以反映機體的整體抗氧化能力。先前的研究表明，PQ誘導(dǎo)會引發(fā)仔豬嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。與此結(jié)果一致，我們的數(shù)據(jù)還顯示，PQ處理降低了肝臟中GSH-Px活性和T-AOC水平，并增加了MDA和H₂O₂水平。更重要的是，飼糧中添加水飛薊賓可提高SOD和GSH-Px活性以及T-AOC水平，從而降低H₂O₂含量和脂質(zhì)過氧化水平。另一項研究也證實，添加水飛薊素可以通過降低肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量來保護后備母豬免受氧化應(yīng)激。江等（2020）報道，添加水飛薊素可通過提高母豬血清中CAT和GSH-Px活性來緩解妊娠引起的氧化應(yīng)激。這些結(jié)果表明，飼糧中添加水飛薊賓可通過調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)的功能來緩解氧化應(yīng)激。

如上所述，水飛薊賓的保肝作用可能與其調(diào)節(jié)抗氧化能力密切相關(guān)。因此，我們進一步研究水飛薊賓對肝臟Nrf2信號通路激活的影響。Nrf2/Keap1信號在抗氧化損傷中起重要作用。氧化還原狀態(tài)受損誘導(dǎo)Nrf2與Keap1分離并易位到細(xì)胞核中，然后與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)下游抗氧化基因（如CAT、SOD和GPx）的表達，從而應(yīng)對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，添加水飛薊賓顯著提高了Nrf2蛋白的表達，SOD1、GPX1和GPX4mRNA的表達也與Nrf2蛋白表達的變化趨勢一致，說明飼糧添加水飛薊賓增強了PQ誘導(dǎo)仔豬的抗氧化能力。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加水飛薊賓可通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路提高斷奶仔豬腸道抗氧化能力。另有研究表明，水飛薊賓通過激活Nrf2/Keap1通路減輕硫代乙酰胺誘導(dǎo)的急性肝損傷。體外研究也證實，添加水飛薊賓可通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路減清H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。綜上所述，飼糧中添加水飛薊賓通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路，從而增強仔豬的抗氧化能力，減輕了肝臟損傷。

氧化應(yīng)激可引發(fā)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)又可直接加劇氧化還原失衡。促炎細(xì)胞因子含量的增加與炎癥反應(yīng)的激活密切相關(guān)。在本研究中，與對照組相比，PQ升高了肝臟中TNF-α和IL-8的分泌及其基因表達。然而，飼糧中添加水飛薊賓顯著扭轉(zhuǎn)了這一趨勢，提高了PQ誘導(dǎo)仔豬的IL-10濃度，這表明水飛薊賓通過減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來減輕PQ誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)。與我們的研究結(jié)果一致，飼糧中的水飛薊賓劑量依賴性地通過抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，改善了雷公藤甲素誘導(dǎo)的大鼠肝損傷。同樣，水飛薊賓可降低泌乳母豬血清TNF-α和IL-1β濃度。眾所周知，NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，在受到外界刺激激活后，可促進下游靶基因的表達和炎癥介質(zhì)的分泌。先前的一項研究發(fā)現(xiàn)，PQ誘導(dǎo)通過提高斷奶仔豬肝臟中NF-κB的磷酸化水平而引發(fā)炎癥反應(yīng)。在本研究中，PQ處理后P-NF-κB和NF-κB蛋白豐度也有所增加，但與PQ處理組相比，水飛薊賓顯著抑制了P-NF-κB和NF-κB蛋白的表達。NF-κB信號的鈍化進一步降低了促炎細(xì)胞因子的表達，這與肝臟細(xì)胞因子水平的改變趨勢是一致的。與我們的研究結(jié)果一致，一些研究也報道了水飛薊賓抑制NF-κB信號級聯(lián)以緩解肝臟炎癥和脂肪性肝炎。綜上所述，這些結(jié)果表明，飼糧中添加水飛薊賓通過抑制NF-κB通路的激活來降低炎癥細(xì)胞因子的表達，從而緩解肝臟炎癥信號傳導(dǎo)。

肝臟中含有大量線粒體，線粒體在細(xì)胞生物能量學(xué)、調(diào)節(jié)氧化還原平衡和細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。線粒體呼吸鏈由5個酶復(fù)合物組成，主要負(fù)責(zé)通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。氧化應(yīng)激可通過擾亂細(xì)胞生物能量學(xué)而引起線粒體功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激降低了肝臟線粒體復(fù)合體I和V的活性，降低了NDUFV2（復(fù)合體I）和ATP5H（復(fù)合體V）mRNA的表達水平。然而，添加水飛薊賓減輕了PQ的有害影響，使呼吸鏈基因的異常表達正?；?，隨后恢復(fù)了仔豬肝臟線粒體復(fù)合物的活性，從而提高了ATP的產(chǎn)生。這與我們之前的研究一致，表明飼糧中添加水飛薊賓通過增加斷奶仔豬腸道線粒體復(fù)合物活性和ATP含量來改善線粒體功能。此外，另一項研究也表明，水飛薊賓通過恢復(fù)肝臟線粒體呼吸鏈活性（所有五種復(fù)合物）來改善NAFLD誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。線粒體功能的維持需要在分裂和融合過程之間取得適當(dāng)?shù)钠胶?。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PQ處理增加了線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1的表達水平，降低了線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn2的表達水平，這意味著PQ處理破壞了線粒體分裂和融合的平衡。相反，補充水飛薊賓可顯著改善PQ誘導(dǎo)下的線粒體動態(tài)失衡。一項體外研究也表明，水飛薊賓處理通過調(diào)節(jié)OPA1和Drp1蛋白表達，保護人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-2SY5Y細(xì)胞免受H₂O₂誘導(dǎo)的線粒體損傷。綜上所述，添加水飛薊賓通過改善線粒體功能來保護仔豬免受PQ誘導(dǎo)的肝損傷。

先前的研究表明，線粒體功能障礙可加劇氧化應(yīng)激并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝臟損傷和功能障礙。Caspase3是細(xì)胞凋亡過程中必不可少的劊子手，可被Caspase9異源激活。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中的水飛薊賓通過拮抗caspase3和caspase9活性的增加來抑制PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這與之前的研究結(jié)果一致，即水飛薊賓預(yù)處理降低了H₂O₂誘導(dǎo)的caspase-3陽性細(xì)胞的百分比，添加水飛薊賓抑制了PQ刺激誘導(dǎo)的腸道caspase3和caspase9活性的增加。有趣的是，飼糧中添加水飛薊賓也會降低未誘導(dǎo)仔豬肝臟中caspase3和caspase9的活性。這些結(jié)果表明，水飛薊賓具有潛在的抗凋亡能力。在Bcl-2家族成員中，Bcl-2和Bax蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，前者具有抗凋亡作用，后者具有相反作用。在本研究中，添加水飛薊賓通過增強抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和Bcl-2與Bax的比值，抑制促凋亡蛋白Cleaved caspase3的表達，從而阻止PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這可能進一步闡明了飼糧中添加水飛薊賓減輕PQ誘導(dǎo)的肝損傷的潛在機制。在體內(nèi)和體外模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。綜上所述，水飛薊賓通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax信號通路抑制PQ誘導(dǎo)的仔豬肝細(xì)胞凋亡。

5.結(jié)論

我們的研究表明，飼糧中添加水飛薊賓可以減輕PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對斷奶仔豬的肝損傷，其機制與增強抗氧化能力、減輕炎癥反應(yīng)、改善線粒體功能和抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

這些研究結(jié)果為在動物飼料中應(yīng)用水飛薊賓作為抗氧化劑，通過飲食干預(yù)改善肝臟健康提供了理論依據(jù)。

參考文獻（略）